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论文解读--鰤鱼诺卡氏菌分泌型PLC蛋白的亚细胞定位及功能研究

出处:水生动物健康评估公众号 作者:陈建林 水产养殖网 2019-07-22 11:13:00
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鰤鱼诺卡氏菌在分类学上属放线菌目、诺卡氏菌科、诺卡氏菌属。鰤鱼诺卡氏菌在感染鱼体后,可被鱼体中的巨噬细胞等吞噬细胞所吞噬,并可逃避吞噬细胞杀灭而在胞内持久生存。病原菌逃避巨噬细胞杀灭的机制一直是相关疾病学研究的关注热点,各种病原菌的胞内生存机制各有特色、不尽相同。有研究表明胞内寄生菌可通过病原菌抗巨噬细胞吞噬作用、抗巨噬细胞内吞噬溶酶体降解作用、诱导和抑制巨噬细胞凋亡或坏死等途径,影响巨噬细胞清除病原菌的能力。诺卡氏菌属病原菌在被宿主巨噬细胞吞噬后,可以抵抗巨噬细胞杀灭并在其内存活,这一过程中诺卡氏菌的常用策略就是诱导巨噬细胞的凋亡。

影响病原菌致病能力的因素主要包括荚膜多糖、细胞壁、黏附素、胞外酶、细胞毒素等,这些统称为毒力因子。细菌导致细胞凋亡是多毒力因子综合作用的结果,近年来,对细菌导致细胞凋亡的机理研究不断深入,发现磷脂酶PLC是一种毒力因子,能够水解真核细胞膜卵磷脂和鞘磷脂,导致细胞裂解凋亡。该研究通过分泌蛋白鉴定、亚细胞定位及过表达试验等对鰤鱼诺卡氏菌NsPLC蛋白功能进行研究,主要的研究结果如下:

1、分泌蛋白鉴定结果
  经过对鰤鱼诺卡氏菌N. seriolae胞外产物进行shotgun质谱鉴定,结果鉴定到了三个肽段“QAADPNSELAR”、“FEGITGPIGLGYR”、“GGLVASETFDHTSQLR”,证明N. seriolae PLC基因编码的蛋白NsPLC是分泌蛋白。

2、NsPLC亚细胞定位
 亚细胞定位结果显示,以pEGFP-N1转染的FHM细胞,其绿色荧光呈全细胞分布,细胞核边缘较光滑,染色均匀,无细胞凋亡特征;以pEGFP-PLC转染FHM细胞后绿色荧光呈团块状分布在细胞质,聚附于细胞核。
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图1 NsPLC蛋白在FHM细胞内的定位

3、NsPLC过表达对FHM细胞的影响
真核过表达结果显示,与对照组pcDNA 3.1-His A相比,转染pcDNA-PLC的FHM细胞凋亡小体大幅度增加。在光镜下,发生细胞凋亡的细胞变圆,与邻近细胞脱离,折光率变高。说明鰤鱼诺卡氏菌NsPLC蛋白可能诱导FHM细胞凋亡,是潜在的毒力因子。
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图2 NsPLC蛋白过表达FHM细胞的细胞核观察

4、线粒体膜电位(ΔΨm)与caspase-3活性检测
将pcDNA-PLC和pcDNA 3.1-His A转染FHM细胞,在所示时间点进行线粒体膜电位(ΔΨm)和Caspase-3活性检测。数据显示与转染pcDNA3.1-HisA的细胞相比,转染pcDNA-PLC细胞的线粒体膜电位(ΔΨm)明显下降,Caspase-3明显上升。
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图3 NsPLC蛋白过表达后FHM细胞的凋亡检测

小结

该研究生物信息学分析发现NsPLC属于PLC家族,是一种具有Tat信号肽的分泌蛋白;通过对N. seriolae胞外产物进行shotgun质谱鉴定,证明NsPLC属于分泌蛋白,推测NsPLC蛋白是通过Tat途径分泌;成功克隆了N. seriolae PLC基因,亚细胞定位和过表达研究都显示NsPLC蛋白在FHM细胞中表达后,细胞核出现固缩、裂解,产生凋亡小体等细胞凋亡特征;线粒体膜电位(ΔΨm)与Caspase-3活性检测证明NsPLC能够引起细胞凋亡。该研究为进一步了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理奠定了基础。

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